离体组织双光子荧光成像检测_CMA/CNAS资质，中析研究所官网|检测中心

技术概述

离体组织双光子荧光成像检测是一种基于双光子激发原理的高分辨率三维光学成像技术，广泛应用于生物医学研究、药物开发、病理分析等领域。该技术利用飞秒级近红外脉冲激光作为激发光源，当两个光子几乎同时被荧光分子吸收时，荧光团才能被激发并发出荧光信号。由于双光子吸收的概率与激发光强度的平方成正比，荧光激发仅发生在物镜焦点附近的极小区域内，因此无需物理切片即可实现天然的三维层切成像能力。

与传统的单光子共聚焦显微技术相比，双光子荧光成像具有多项显著优势。首先，近红外激发光的组织穿透深度更大，通常可达到数百微米甚至更深的层次，远超可见光激发的成像深度；其次，由于激发区域高度局域化，组织受到的光损伤和光漂白效应显著降低，有利于对活体离体组织进行长时间动态观察；此外，近红外光对生物组织的散射和吸收更少，成像背景噪声低，信噪比高。

在离体组织检测中，该技术既可以利用组织内源性荧光物质（如NADH、FAD、胶原、弹性蛋白等）进行无标记成像，也可以结合外源性荧光探针或基因编码荧光蛋白，实现对特定分子、细胞结构或生理过程的靶向观测。同时，结合二次谐波成像（SHG）、荧光寿命成像（FLIM）等模式，可获得更为丰富的结构与功能信息，为组织形态学评价、代谢状态分析和药物分布研究提供强有力的技术支撑。

检测样品

离体组织双光子荧光成像检测适用的样品类型十分广泛，涵盖了大多数动物和人体的新鲜或固定离体组织。为保证成像质量与数据的可靠性，样品的采集、保存和运输环节需要遵循相应的规范要求。

常见检测样品包括：

皮肤组织：表皮、真皮全层组织，用于研究皮肤结构、胶原分布及经皮药物渗透；
肿瘤组织：各类实体瘤离体标本，用于观察肿瘤细胞分布、血管网络及微环境特征；
神经组织：脑组织、脊髓组织切片，用于神经环路、神经元形态及钙成像研究；
肝脏、肾脏、心脏等内脏组织：用于毒理学评价、缺血再灌注损伤及代谢研究；
肺、肠道、胰腺等组织：用于炎症模型、纤维化进程及细胞间相互作用分析；
血管组织：主动脉、冠状动脉等，用于血管壁结构与斑块成分分析；
骨、软骨及角膜等透明或半透明组织：用于组织工程支架评价与结构成像；
植物组织：叶片、根茎等离体样品，用于植物细胞结构与荧光标记研究。

样品制备方面，一般建议新鲜组织离体后尽快进行检测，保存过程中应置于适宜的培养液或缓冲液中低温保存，避免干燥、挤压和反复冻融。样品厚度通常建议控制在数百微米至一毫米左右，以保证激光能够有效穿透至目标深度。对于经过固定的组织样品，应根据检测项目选择合适的固定方式，并评估固定过程对荧光信号可能造成的影响。

检测项目

根据研究目的和样品特性的不同，离体组织双光子荧光成像检测可开展多种类型的检测项目，主要包括以下几类：

组织三维结构成像：对离体组织进行逐层光学切片，重建三维立体结构，观察深层组织形态；
胶原蛋白分布检测：利用二次谐波信号无标记检测组织中胶原纤维的排列、密度与形态变化；
弹性纤维与细胞外基质成像：观察基质网络结构及其在病变条件下的重构情况；
内源性代谢荧光检测：基于NADH、FAD等内源荧光分子的自发荧光强度与寿命，评估细胞代谢状态；
外源荧光探针标记成像：对特定分子、离子、细胞器或细胞类型进行靶向荧光标记与成像；
荧光寿命成像（FLIM）：通过荧光衰减特性分析分子的微环境与相互作用；
药物组织分布与渗透检测：观察荧光标记药物在组织中的空间分布、渗透深度与滞留情况；
血管网络成像：结合荧光染料灌注或内源信号，观察组织血管的立体结构与完整性；
深度穿透成像：评估不同组织类型中的最大成像深度与信号衰减规律；
时间序列动态成像：对离体活组织进行长时间动态观察，记录生理或药理刺激下的实时变化。

上述检测项目可根据实际科研需求单独开展，也可组合进行多维度的综合分析，从而获得组织结构、分子表达与功能状态相结合的全面数据。

检测方法

离体组织双光子荧光成像检测的流程一般包括样品接收与评估、样品制备、上机成像、数据处理与分析、结果报告出具等环节，具体方法如下：

第一步，样品接收与前处理。收到样品后，技术人员首先对样品的类型、状态、保存条件进行评估，确认其是否满足双光子成像的基本要求。对于新鲜组织，需在适宜的温度和液体环境中进行处理；对于需要标记的样品，则进行荧光探针孵育、染色或转染等前处理操作。

第二步，成像参数设定。根据目标荧光团的激发特性选择合适的激发波长，设定激光功率、扫描速度、针孔或非失焦探测参数、z轴步进距离等关键参数，并在预扫描中优化信噪比，避免过强的激光功率造成样品损伤或荧光淬灭。

第三步，图像采集。将处理好的样品置于载物台，通过水浸或油浸高数值孔径物镜进行逐层扫描，采集不同深度的二维光学切片，形成完整的z轴层扫数据栈。对于需要多通道同时成像的样品，可同步采集发射光谱不同波段内的信号，并结合二次谐波通道获取胶原信息。

第四步，数据处理与分析。利用专业图像分析软件对采集的三维图像进行去噪、伪彩合成、三维重建、荧光强度定量、深度分布曲线绘制、共定位分析等处理，提取与检测项目相关的定量指标。

第五步，结果解读与报告出具。由专业技术人员对图像与分析结果进行综合解读，形成包含典型图像、定量数据和分析结论的完整检测报告，为客户提供可直接用于科研论文或项目申报的数据支持。

检测仪器

离体组织双光子荧光成像检测依托高端显微成像系统完成，核心仪器设备包括以下几个部分：

双光子激光扫描显微镜系统：配备高数值孔径物镜、高精度z轴控制系统和多通道荧光探测模块，是成像检测的核心平台；
飞秒级近红外脉冲激光器：通常为可调谐钛宝石激光器或固定波长飞秒激光器，提供700纳米至1000纳米以上波段的高峰值功率激发光；
高灵敏度探测器：包括光电倍增管及非去扫描探测器，可高效收集组织深层散射出的微弱荧光信号；
多通道光谱分光系统：实现对多个荧光通道及二次谐波信号的同步分离与采集；
活细胞/活组织环境控制模块：提供温度、湿度与气体环境控制，保障离体活组织的生理状态；
专业图像采集与分析软件：支持三维重建、荧光定量、寿命分析与数据可视化等综合功能；
辅助制样设备：包括振动切片机、冰冻切片机、共聚焦专用载玻片与培养皿等，保证样品制备质量。

完善的仪器配置与规范的仪器维护校准体系，是保障检测数据准确性与可重复性的基础。检测机构会定期对激光器功率、探测器灵敏度与系统分辨率进行核查，确保每批次检测均在稳定可靠的仪器状态下完成。

应用领域

离体组织双光子荧光成像检测凭借其深层成像、低损伤、高分辨率的特点，在生命科学与医学研究的众多领域发挥着重要作用：

肿瘤学研究：观察肿瘤组织的三维结构、细胞侵袭方式、血管新生及药物在瘤内的分布与渗透；
神经科学研究：对脑组织深部神经元与神经环路进行成像，研究神经退行性疾病模型中的结构改变；
皮肤科学与化妆品评价：检测皮肤分层结构、胶原含量变化、功效成分的经皮渗透行为；
药物研发与药效评价：直观展示候选药物在靶组织中的分布、代谢与清除过程，辅助药效与安全性判断；
毒理学与病理研究：评估化学物质、环境因子对组织结构与细胞代谢造成的损伤；
组织工程与再生医学：评价支架材料与再生组织的结构整合度、细胞浸润与基质沉积情况；
代谢类疾病研究：通过内源荧光代谢指标分析糖尿病、脂肪肝等模型组织的代谢异常；
心血管研究：观察血管壁胶原与弹性纤维结构变化，分析动脉粥样硬化等病变特征；
基础生物学教学与科研：为高校和科研院所提供高质量的显微成像数据与技术支持。

随着双光子成像技术的不断普及与探针化学的快速发展，该项检测的应用边界仍在持续拓展，为各领域的科学研究提供了越来越丰富的技术手段。

常见问题

问题一：离体组织双光子荧光成像检测的检测周期是多久？

一般情况下，离体组织双光子荧光成像检测的周期为7-15个工作日。具体周期会受到多种因素的影响，例如检测项目的数量与复杂程度、样品的数量与类型、是否需要荧光探针标记及孵育时间、是否涉及活组织动态时序成像，以及图像后处理与定量分析的工作量等。如果样品数量较多或需要开展多通道、多参数的综合分析，周期可能会相应延长；反之，常规成像项目则可能在较短时间内完成。对于时间紧迫的客户，可在项目确认前沟通加急安排，实验室会根据实际情况合理调配机时，尽量满足客户的时间要求。

问题二：离体组织双光子荧光成像检测的价格是多少？

离体组织双光子荧光成像检测的费用受多方面因素影响，难以一概而论。主要影响因素包括：所选检测项目的类型与数量、成像通道的数量、是否需要荧光标记及标记探针的种类、样品数量与制备难度、成像深度与三维层扫的规模、是否需要进行荧光寿命成像等特殊模式、数据后处理与定量分析的复杂程度，以及检测周期是否存在加急需求等。不同客户的研究目标差异较大，检测方案也会相应定制。建议客户在送检前与我们联系，说明样品情况与检测需求，技术人员将根据具体方案提供准确的报价信息。

问题三：离体组织样品需要多厚才适合双光子成像？

双光子成像的组织穿透深度通常可达数百微米，部分透明度较高的组织甚至可以更深。一般建议样品厚度控制在几百微米至一毫米左右，具体取决于组织类型、透明度、散射特性以及目标观测深度。对于较厚的样品，实验室也可以通过振动切片等方式将其制备为适当厚度的组织片再进行成像。送检前建议与技术人员沟通，确定最适宜的样品尺寸与制备方式，以获得最佳的成像效果。

问题四：固定后的组织样品还能进行双光子荧光成像检测吗？

可以进行成像，但效果与固定方式密切相关。多聚甲醛固定的组织通常能够较好地保持组织形态，胶原的二次谐波信号一般不受明显影响；但固定过程可能会削弱部分内源性荧光信号（如NADH、FAD等代谢荧光），因此基于代谢状态的检测更适合使用新鲜组织。此外，若样品带有外源荧光蛋白或荧光探针标记，需评估固定步骤对荧光信号的保留程度。建议客户在送样前说明样品的固定情况，以便实验室选择合适的检测策略。

问题五：双光子成像与共聚焦成像相比有什么区别？

两者的核心区别在于激发方式与成像深度。共聚焦显微镜采用单光子可见光激发，通过针孔消杂光实现光学层切，但组织穿透深度有限，一般仅适合较薄的样品；双光子成像采用近红外飞秒激光激发，荧光激发高度集中于焦点区域，天然具备三维层切能力，组织穿透深度更大，光损伤与光漂白更小，特别适合对厚组织、离体活组织进行深层成像。此外，双光子成像还能与二次谐波成像联用，无标记检测胶原等非中心对称结构，是共聚焦技术的有力补充。

问题六：检测报告中可以提供哪些数据和成果？

检测报告一般包括样品信息与处理方式、成像条件与参数、各通道典型二维图像与三维重建图像、荧光强度定量结果、深度分布曲线（如需要）、共定位或寿命分析数据（视检测项目而定），以及技术人员对结果的专业分析与说明。原始图像数据可根据客户需求一并交付，图像格式与分析导出方式可按科研论文或项目报告的要求进行整理，方便客户直接用于后续的数据展示与成果发表。