耐胆盐性能定量测试

其他检测 2026-08-29 11 次浏览来源：北京中科光析科学技术研究所

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技术概述

耐胆盐性能定量测试是评价益生菌、乳酸菌等微生物在模拟肠道环境中生存能力的重要检测手段。胆盐作为人体肝脏分泌的胆汁主要成分，在脂肪消化过程中发挥着不可替代的作用，但其具有较强的抑菌活性，能够破坏细菌细胞膜结构，导致菌体死亡。对于益生菌制品而言，菌株能否顺利通过胃酸环境并在肠道中定植存活，直接关系到其功效的发挥。因此，耐胆盐性能成为衡量益生菌产品质量和功效的核心指标之一。

从生理学角度来看，人体肠道内的胆盐浓度通常在0.3%至0.5%之间波动，且在不同肠段存在差异。十二指肠部位胆盐浓度最高，随着肠道蠕动逐渐降低。耐胆盐性能定量测试正是基于这一生理特点，通过设置不同浓度的胆盐环境，模拟微生物在肠道中的生存挑战。该测试不仅能够定性判断菌株是否具有耐胆盐能力，更能够通过精确的定量分析，计算出具体的存活率和耐受指数，为产品研发和质量控制提供科学依据。

在检测原理层面，耐胆盐性能定量测试主要依据微生物在不同胆盐浓度条件下的生长动力学特征。测试过程中，将待测菌株接种于含有特定浓度胆盐的培养基中，经过适当的培养时间后，通过平板计数法或光电比浊法测定存活菌数，与空白对照组进行比较，计算存活率。该方法具有操作规范、结果可重复、数据可量化等优点，已成为益生菌行业标准的检测方法之一。

随着益生菌产业的快速发展，消费者对产品质量的关注度日益提升，耐胆盐性能定量测试的重要性也愈发凸显。通过该测试，企业可以筛选出性能优异的菌株，优化产品配方，提高产品功效；监管部门可以依据测试结果对市场产品进行质量监督；消费者则可以借助测试报告判断产品的真实价值。可以说，耐胆盐性能定量测试贯穿于益生菌产品研发、生产、销售的全生命周期，是保障行业健康发展的重要技术支撑。

检测样品

耐胆盐性能定量测试的适用样品范围广泛，涵盖了益生菌产业链的多个环节。根据样品形态和来源的不同，可将其分为以下几大类别：

益生菌原料菌株：包括从自然界分离筛选的原始菌株、经过诱变或基因改造的改良菌株、以及保藏于菌种中心的专利菌株。这类样品通常以冻干粉或甘油管保藏形式提供，是耐胆盐测试的主要对象，用于菌株筛选和功效评价。
益生菌发酵剂：用于食品发酵生产的直投式发酵剂(DVS)或继代式发酵剂，如酸奶发酵剂、干酪发酵剂、泡菜发酵剂等。该类样品需要评估其中功能性菌株的耐胆盐能力，以确保其在最终产品中的功效。
益生菌终端产品：包括各类含有活菌的食品、保健品和药品。具体形式有：益生菌粉剂、胶囊、片剂、滴剂、益生菌饮料、发酵乳制品、益生菌巧克力、益生菌口香糖等。此类样品的测试结果直接反映产品的实际功效。
乳酸菌饮料：以乳酸菌为主要功能成分的液体饮料，包括活菌型和杀菌型两大类。活菌型产品需要进行耐胆盐测试以验证菌株在模拟肠道环境中的存活能力。
发酵乳制品：如酸奶、酸牛奶、开菲尔、马奶酒等传统发酵乳制品。这些产品中的乳酸菌群是否具有耐胆盐能力，关系到其在肠道中的定植效果。
其他功能性食品：含有益生菌的功能性糖果、烘焙食品、婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品等。随着益生菌应用领域的不断拓展，此类样品的送检量逐年增加。

需要注意的是，不同形态的样品在检测前需要进行相应的前处理。固体样品需要溶解稀释；液体样品可直接取样或离心收集菌体；含油脂样品需要去除油脂成分；含包埋材料的样品需要先破壁释放菌体。规范的前处理流程是确保检测结果准确可靠的前提条件。

检测项目

耐胆盐性能定量测试涉及多个核心检测项目，每个项目从不同角度反映菌株的胆盐耐受特性：

存活率测定：这是最基础也是最核心的检测项目。通过对比处理组（含胆盐）与对照组（不含胆盐）的活菌数，计算存活率百分比。计算公式为：存活率(%)=(处理组活菌数/对照组活菌数)×100%。存活率越高，表明菌株的耐胆盐能力越强。
耐受指数计算：在存活率基础上，引入时间因素，计算菌株在胆盐环境中随时间变化的存活曲线下面积，得到耐受指数。该指标综合反映了菌株的耐受强度和耐受持续时间，具有更高的区分度。
半致死浓度测定(LC50)：通过设置一系列胆盐浓度梯度，测定使菌株存活率降至50%时的胆盐浓度。LC50值越高，表明菌株对胆盐的耐受能力越强。该指标常用于不同菌株间的横向比较。
生长曲线分析：在含有胆盐的培养体系中连续监测菌株的生长动态，绘制生长曲线，分析延迟期、对数生长期和稳定期的变化特征。耐胆盐能力强的菌株在胆盐环境中延迟期较短，能够较快进入对数生长期。
胆盐水解酶活性检测：某些益生菌能够产生胆盐水解酶，将结合型胆盐分解为游离型胆盐，从而降低胆盐的抑菌作用。该酶活性与菌株的耐胆盐能力存在一定相关性，是重要的辅助检测指标。
细胞膜完整性评估：通过测定细胞内物质外泄、细胞膜通透性变化等指标，评估胆盐对菌体细胞膜的损伤程度。该检测有助于阐明菌株耐胆盐的机制。
最小抑制浓度(MIC)测定：采用微量肉汤稀释法或琼脂稀释法，测定能够完全抑制菌株生长的最小胆盐浓度。MIC值是评价菌株耐胆盐能力的重要参数。

上述检测项目可根据客户需求和样品特性进行组合选择，形成定制化的检测方案。对于研发阶段的菌株筛选，建议进行全面的检测项目；对于产品质量控制，存活率测定通常已能满足需求。

检测方法

耐胆盐性能定量测试的方法体系经过多年的发展完善，已形成多种标准化检测方案，可根据样品类型和检测目的灵活选择：

一、平板计数法

这是最经典也是最常用的耐胆盐定量测试方法，通过测定活菌数来评估菌株的胆盐耐受能力。具体操作流程如下：

样品制备：将待测菌株活化培养至对数生长期，用无菌生理盐水或PBS缓冲液调整菌悬液浓度至约10^8 CFU/mL。
胆盐处理：取适量菌悬液接种于含有不同浓度胆盐(通常设置0.1%、0.3%、0.5%三个浓度)的液体培养基中，同时设置不含胆盐的对照组。
培养孵育：将处理组和对照组置于适宜温度下培养一定时间(通常为1-4小时)，模拟肠道过境过程。
梯度稀释：培养结束后，将样品进行10倍系列稀释，选取合适稀释度进行平板涂布或倾注。
菌落计数：经适宜温度培养后，计数平板上的菌落数，计算存活率。

该方法结果直观、数据可靠，是国标方法和行业标准的推荐方法。

二、微量肉汤稀释法

该方法适用于高通量筛选和MIC测定，具有节省试剂、操作简便的优点：

在96孔板中制备含有两倍系列稀释浓度胆盐的培养液，每孔接种等量菌悬液。
将96孔板置于培养箱中培养18-24小时。
通过肉眼观察或酶标仪测定吸光度，判断各孔的细菌生长情况。
无菌生长的最低胆盐浓度即为MIC值。

三、光电比浊法

通过连续监测菌液浊度的变化，实时评估菌株在胆盐环境中的生长情况：

将菌株接种于含胆盐的液体培养基中，置于带有自动监测功能的培养设备中。
设备每隔一定时间自动测定培养液的吸光度。
绘制生长曲线，分析延迟期延长程度和最大比生长速率的变化。

该方法能够动态反映菌株的耐胆盐过程，数据量大、信息丰富。

四、流式细胞术

利用荧光探针标记和流式细胞仪检测，可快速分析胆盐处理后菌体的存活状态和细胞膜完整性：

用荧光染料(如碘化丙啶、羧基荧光素二醋酸盐)标记处理后的菌悬液。
通过流式细胞仪检测荧光信号，区分活菌、死菌和受损菌。
获得存活率和细胞损伤程度的定量数据。

该方法检测速度快，可分析单个细胞水平的信息，适合深入研究胆盐的作用机制。

五、模拟肠道模型法

采用人工构建的体外模拟肠道系统，模拟食糜在消化道中的流动、消化和吸收过程：

构建包含胃、小肠、大肠等多个反应单元的模拟系统。
设置各单元的温度、pH、消化酶和胆盐浓度等参数。
将样品投入系统，在不同节点取样检测存活菌数。

该方法最大程度还原了体内环境，结果更接近真实的生理状态，但设备要求较高，检测周期较长。

检测仪器

耐胆盐性能定量测试的顺利开展需要依赖一系列专业化的仪器设备，这些设备在检测过程中各司其职，共同保障检测结果的准确性和可靠性：

恒温培养箱：提供菌株培养所需的恒温环境，温度控制精度通常要求在±0.5℃以内。根据菌株类型选择适宜的培养温度，如乳酸菌通常采用37℃培养，某些嗜热菌则需要更高温度。高级型号具备温度程序控制功能，可模拟体温波动。
厌氧培养系统：对于双歧杆菌等厌氧菌的检测，需要提供无氧或低氧培养环境。厌氧工作站或厌氧培养罐配合产气剂使用，可有效排除氧气干扰，保证厌氧菌的正常生长。
生物安全柜：提供洁净的操作环境，防止样品交叉污染和操作人员暴露风险。II级生物安全柜可同时保护人员、环境和样品，是微生物检测实验室的标准配置。
酶标仪：用于微量肉汤稀释法中吸光度的快速测定，可同时检测96孔板中各孔的浊度变化。高端型号具备温度控制和震荡功能，可实现在线监测。
分光光度计：测定菌悬液浓度和培养液浊度，用于生长曲线的绘制。紫外-可见分光光度计可在600-660nm波长下测定细菌浓度，测量范围广、精度高。
流式细胞仪：利用激光诱导荧光原理，快速分析大量单细胞。配合适当的荧光探针，可在数分钟内分析数万个细胞，给出存活率、细胞大小、膜完整性等多维信息。
菌落计数仪：自动识别和计数平板上的菌落，大幅提高工作效率。现代菌落计数仪配备高分辨率摄像头和智能图像分析软件，可准确识别不同形态、不同颜色的菌落。
超净工作台：提供局部百级洁净度的操作空间，用于样品的稀释、涂布等无菌操作。垂直流或水平流超净台可根据实验室布局灵活选择。
高压蒸汽灭菌器：对培养基、器皿等进行灭菌处理，确保检测过程不受杂菌干扰。实验室常用立式或卧式灭菌器，灭菌温度可达121℃以上。
pH计：准确测定培养基和样品的pH值。胆盐培养基的pH需要精确控制，以模拟肠道真实的酸碱环境。精密pH计的测量精度可达0.01pH单位。
离心机：用于菌体的收集和洗涤。高速冷冻离心机可快速沉淀菌体，同时保持低温环境，避免温度对菌株活力的影响。
电子天平：精确称量试剂和样品。分析天平的称量精度可达0.0001g，满足试剂配制和样品称量的要求。

上述仪器设备的定期校准和维护是保证检测质量的重要环节。实验室应建立完善的仪器管理制度，确保仪器处于良好的工作状态。

应用领域

耐胆盐性能定量测试的应用范围广泛，涵盖了益生菌产业的多个领域，为产品质量控制、科学研究和行业监管提供了有力的技术支撑：

一、益生菌菌株筛选与开发

在益生菌产品研发阶段，需要从大量候选菌株中筛选出具有优良耐胆盐特性的菌株。耐胆盐性能定量测试是菌株筛选的核心评价手段之一。通过对分离自不同来源的菌株进行系统测试，可以建立菌株耐受性数据库，为产品配方设计提供依据。优秀的益生菌菌株应能在0.3%以上胆盐浓度下保持较高的存活率，这是其能够在肠道定植并发挥作用的前提。

二、益生菌产品质量控制

在益生菌产品的生产过程中，原料验收、中间品控制和成品检验都需要进行耐胆盐性能测试。该测试已成为益生菌产品的常规质控项目，检测结果作为产品放行的重要依据。通过批次间的数据对比，可以监控产品质量的稳定性，及时发现生产过程中的异常情况。部分企业还将耐胆盐性能作为产品等级划分的标准，实现产品的差异化定位。

三、功能性食品功效验证

随着功能性食品市场的快速发展，产品的功效宣称需要有科学数据支撑。耐胆盐性能作为益生菌类功能食品的核心功效指标，其测试数据是产品申报保健食品批文、进行功能声称的重要技术资料。监管部门在审批过程中，会重点审查产品的耐胆盐测试报告，以验证其功能声称的真实性和可靠性。

四、科研学术研究

在益生菌相关的科研领域，耐胆盐性能定量测试是研究菌株耐受机制、开发新型保护技术的基础实验方法。研究人员通过对比不同菌株的耐胆盐能力差异，探索影响耐受性的关键因素；通过基因组学和蛋白质组学技术，解析耐胆盐的分子机制；通过优化培养条件和添加保护剂，提高菌株的胆盐耐受能力。这些研究成果推动了益生菌产业的持续创新。

五、活菌制剂稳定性研究

益生菌产品在保质期内的活菌数和功效稳定性是影响消费者体验的关键因素。耐胆盐性能测试可作为稳定性研究的监测指标之一，评估产品在储运过程中菌株耐受能力的保持情况。通过加速稳定性试验和长期稳定性试验，可以预测产品的货架期，指导包装设计和储运条件的优化。

六、微生态制剂临床研究

在微生态制剂的临床应用研究中，耐胆盐性能测试有助于解释菌株在人体内的定植效果和作用机制。将体外测试结果与临床试验数据进行关联分析，可以建立预测模型，指导菌株的临床选择。对于特定适应症的研究，耐胆盐测试数据还可用于优化给药方案，提高治疗效果。

七、食品安全风险评估

对于某些食源性致病菌，其耐胆盐能力与致病性存在一定关联。通过耐胆盐性能测试，可以评估致病菌在肠道环境中的存活和定植风险，为食品安全风险评估提供参考数据。此外，该测试也可用于评价食品防腐体系的有效性，筛选能够抑制耐胆盐致病菌的防腐方案。

常见问题

在耐胆盐性能定量测试的实际操作和结果解读过程中，客户经常会遇到各种疑问，以下针对常见问题进行详细解答：

问：不同类型的胆盐对测试结果有影响吗？

答：胆盐类型确实会影响测试结果。常用的胆盐包括牛胆盐、猪胆盐、混合胆盐等，其主要成分和比例存在差异。牛胆盐中牛磺胆酸含量较高，抑菌作用相对较强；猪胆盐中甘氨胆酸比例较高，抑菌作用略弱。国际标准方法通常推荐使用牛胆盐或混合胆盐，以保证结果的可比性。测试报告中应注明所使用的胆盐类型。

问：测试时胆盐浓度如何选择？

答：胆盐浓度的选择应基于研究目的和样品特性。常规测试建议设置0.1%、0.3%、0.5%三个浓度，其中0.3%最接近人体肠道生理浓度。如果旨在筛选高耐受菌株，可提高浓度至1.0%或更高；如果旨在评估产品在特定人群中的适用性，可根据目标人群的胆汁分泌特点调整浓度。例如，高脂肪饮食人群的胆汁分泌量较大，可适当提高测试浓度。

问：培养时间对结果有何影响？

答：培养时间是影响测试结果的重要因素。胆盐对细菌的杀伤作用具有时间依赖性，培养时间越长，存活率越低。标准方法通常采用3小时培养，模拟食物在小肠中的平均停留时间。如果研究特定条件下菌株的长期存活能力，可延长培养时间至24小时或更长，但需在报告中明确说明。不同培养时间的结果不能直接比较。

问：菌龄对耐胆盐性能有影响吗？

答：菌龄对耐胆盐性能有显著影响。对数生长期的菌株代谢活跃，细胞膜流动性高，对胆盐的敏感性较强；稳定期的菌株细胞壁增厚，代谢活性降低，耐受能力相对增强。为保证结果的可重复性，标准方法规定使用培养至对数生长期的菌体进行测试。如果使用不同菌龄的菌体，结果可能存在较大差异。

问：如何判断测试结果的优劣？

答：耐胆盐性能的评价尚无统一的合格标准，通常采用相对比较的方式。一般认为，在0.3%胆盐浓度下存活率超过50%的菌株具有较好的耐胆盐能力；存活率超过80%的菌株属于优良菌株；存活率低于10%的菌株耐胆盐能力较差。不同应用场景对耐受能力的要求不同，益生菌产品通常要求较高存活率，而某些研究目的可能关注耐受机制而非耐受程度。

问：测试过程中需要注意哪些质量控制要点？

答：质量控制是保证检测结果准确可靠的关键。主要控制要点包括：培养基和试剂的质量验收、培养温度和时间的精确控制、稀释和接种操作的规范性、菌落计数的准确性、以及对照试验的设计。实验室应定期进行人员比对和能力验证，确保检测结果的一致性。对于关键参数，建议进行重复测定，取平均值作为最终结果。

问：如何提高菌株的耐胆盐能力？

答：提高菌株耐胆盐能力有多种技术途径。菌株层面，可通过适应性驯化、诱变筛选、基因工程等方法获得耐受性增强的突变株；工艺层面，可采用微胶囊包埋技术，在菌体表面形成保护层，阻隔胆盐的接触；配方层面，可添加脱脂乳、海藻糖等保护剂，减轻胆盐对菌体的损伤。不同方法各有优劣，实际应用中常采用多种技术的组合方案。